Gen Terapisi Bölüm-1
27/2/2008
GEN TERAPİSİ
Genlerin tanımlanması ve genetik mühendisliğinde kaydedilen önemli gelişmeler sonunda bilim adamları artık hastalıklarla savaşabilmek ve onlardan korunabilmek için bazı örneklerde genetik materyali değiştirme aşamasına geldiler.
Başarılı bir gen terapisi için gereken ortak temel elemanlar vardır. Bunların en önemlisi hastalığa neden olan genin belirlenmesi ve klonlanmasıdır. "Human Genome Project" olarak adlandırılan ve insanın gen haritasını çıkarmayı amaçlayan proje tamamlandığında, istenilen genlere ulaşmanın çok daha kolay olacağına inanılmaktadır.
Genin tanımlanmasından sonraki aşamada, genin hedeflenen hücrelere nakledilmesi ve orada ekspresyonu, yani kodladığı proteinin üretimi gelir. Gen terapisinin öteki önemli elemanlarıysa tedavi edilmek istenilen hastalığı ve gen nakli yapılacak hücreleri iyi tanımak ve gen naklinin olası yan etkilerini anlamaktır.
Gen terapisi iki ana kategoride incelenebilir: Eşey hücresi ve vücut hücresi gen terapisi. Eşey hücresi gen terapisinde, genetik bir bozukluğu önlemek için eşey hücrelerinin (sperm ya da ovum) genleri değiştirilir. Bu tip terapide, genlerde yapılan değişiklik kuşaktan kuşağa aktarılabileceğinden, olası bir eşey hücresi gen terapisi hem etik, hem de teknik sorunlar yaratacaktır.
Gen terapisi aynı zamanda bir ilaç taşıma sistemi olarak da kullanılabilir. Burada ilaç, nakledilen genin kodladığı proteindir. Bunun için, istenilen proteini kodlayan bir gen, hastanın DNA'sına yerleştirilebilir. Örneğin ameliyatlarda, pıhtılaşmayı önleyici bir proteini kodlayan gen, ilgili hücrelerin DNA'sına yerleştirilerek, tehlikeli olabilecek kan pıhtılarının oluşumu önlenebilir.
GEN TERAPİSİNİN UYGULAMA ALANLARI
Tarihsel, olarak gen tedavisi talasemi gibi§ klasik kalıtsal hastalıkların tedavisi için düşünülmüştür. Fakat son yıllarda gen tedavisinin çok değişik alanlarda kullanılabileceği ortaya çıkmıştır. Örneğin, HİV tarafından oluşturulan enfeksiyon hastalıkları gibi pek çok edinsel hastalıklar için gen tedavisi yararlı bir araç olarak kullanılmaktadır.
§ Pankreatik adacık hücrelerini genetik olarak düzeltmektense insülin genini deri hücrelerine ya da endotelyal hücrelere sokma.
§ Hemofilide faktör VIII ya da IX genini karaciğer hücrelerine sokarak pıhtılaşma faktörlerinin daha kolay yapılması.
§ Tümör hücrelerinin genetik yapısı düzeltilerek normal hücresel büyüme durumuna getirilmesiyle ya da tümör hücrelerinin genetik kompozisyonunu değiştirmek suretiyle çok geniş tedavi olanakları elde edilmesi.
GEN TERAPİSİNİN TARİHÇESİ
-DNA'nın kalıtsal materyal olarak belirlenmesi 1944
-DNA'nın yapısının belirlenmesi (Watson ve Crick) 1953
-Genetik kod anlaşılması 1961 – 1967
-Restriksiyon enzimlerininbulunması 1968
-Farklı genlerin tek bir canlı hücre
içerisine sokulabilme teknikleri 1973
-Rekombinant DNA teknikleri ile bakterilerde
İnsan büyüme hormonu üretilmesi 1977
-İnsan insulin geni klonlanması 1978
Humilinin ilk kez piyasaya sürülmesi
-Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) geliştirilmesi 1983
-Kistik Fibrozis için ilk genetik marker belirlenmesi 1985
-Supressor genlerin ortaya konması 1986
-Uluslar arası insan genom projesinin başlatılması 1990
-İlk insan gen terapisi 1990
GEN TRANSFER YÖNTEMLERİ
Ex-vivo: Hastadan alınan hücrelerin genetik§ bilgisi, canlı dışında, in vitro koşullarda “doğru gen” ile modifiye edilir ve bu hücreler tekrar hastaya verilir.
§ In- situ: Vektör doğrudan etkilenmiş dokuya aktarılır.
§ In- vivo: “Doğru geni” taşıyan vektör direk olarak hastanın kanına verilir.
VEKTÖR SİSTEMLERİ
Vektör sistemleri 2 çeşittir. Bunlar viral kökenli sistemler ve non-viral sistemlerdir. Basit olmalarına karşın non-viral sistemler verimsizdir; ayrıca, yabancı genler, sadece belirli bir süre fonksiyonel kalabilmektedirler. Bu nedenle araştırmacıların çoğu, genellikle virüs kökenli vektörlere yönelmişlerdir. Virüs kökenli sistemlerde ise;
Virüslerin hastalığa yol açan gen parçalarının yerine, hastaları iyileştirme amacıyla rekombinant genler yerleştirilmektedir. Bu amaçla değiştirilmiş hücreler kullanılmaktadır. Bu hücrelere tedavi edici geni taşıyan bir genetik yapı sokulduğunda, tedavi edici geni içinde taşıyan virüsler elde edilir. Bu şekilde değiştirilmiş virüsler hücreye girmek için kendi yöntemlerini kullanırlar ve genomlarının ekspresyonu sonucu, genin kodladığı protein üretilmeye başlanır. Öte yandan, virüsün kendisini çoğaltmak için ihtiyaç duyduğu genler, tedavi edici genlerle değiştirilmiş olduğundan, virüs çoğalıp hücreyi patlatamaz. Bunu yerine, hücrede virüsün taşıdığı hastalığı düzeltici genin ekspresyonu olur, genin kodladığı protein (yani ilaç) üretilir ve genetik bozukluk nedeniyle üretilemeyen proteinin yerini alır. En çok kullanılan viral vektörler, retrovirüsler, adenovirüsler, herpesvirüsler (uçuk virüsü) ve adeno-ilişkili virüslerdir. İdeal bir vektörde aranan özellikler yüksek titraj, kolay tasarlanabilme, integre olabilme yeteneği ve gen transkripsiyonunun kontrol edilebiliyor olmasının yanında, immünolojik etkilerin olmamasıdır.
Non-Viral Sistemler
1-) Doğrudan DNA Enjeksiyonu: Kılıfı olmayan ya da antikor, protein veya lipide bağlanmamış durumdaki “ çıplak DNA ” direkt olarak enjekte edilir. Yöntem basit olmasına karşın kısıtlı bir uygulama alanı vardır.
2-) Lipozom Formülasyonları: Lipozomlar, lipidlerden oluşan moleküllerdir. DNA'yı içlerine alma mekanizmalarına göre iki guruba ayrılırlar: Katyonik lipozomlar ve pH-duyarlı lipozomlar. Birinci gurup lipozomlar artı yüklü olduklarından, eksi yüklü olan DNA ile dayanıklı bir kompleks oluştururlar. İkinci gurup lipozomlarsa negatif yüklü olduklarından DNA ile bir kompleks oluşturmaz, ama içlerinde taşırlar. Hedeflemenin özgül olmayışı ve geçici transgen ekspresyonu sağlayabilmesi bu yöntemin dezavantajlarındandır
3-) Biolistik Gen Enjeksiyonu: Parça bombardımanı ya da gen tabancası olarak da adlandırılan biolistik DNA enjeksiyonu, ilk olarak bitkilere gen nakli yapmak amacıyla geliştirilmiştir. Bu ilk uygulamalarından sonra, bazı değişiklikler yapılarak memeli hücrelerine gen nakli amacıyla kullanılmaya başlanmıştır. Bu yöntemde, genellikle altın ya da tungstenden oluşan 1-3 mikron boyutunda mikroparçacıklar, tedavi edici geni taşıyan plazmit DNA'sı ile kaplanır, sonra da bu parçacıklara hız kazandırılarak, hücre zarını delip, içeri girmeleri sağlanır.
4-)Moleküler Konjugatlar: Protein veya sentetik ligantlara DNA bağlayıcı ajanların takılmasıyla oluşturulurlar, bu nedenle lipozom için varolan avantaj ve dezavantajlar bu vektör sistemi içinde söz konusudur.
Viral Vektör Sistemleri
1-) Retrovirüsler
Zarflı virüslerdendir. Genomu, tek iplikli RNA molekülüdür. İnfeksiyon sonrası viral genomu ters transkripsiyon ile çift iplikli DNA’ya dönüşerek konak hücre genomuna integre olur ve proteinlerinin ekspresyonunu sağlar. İntegrasyonu stabil olmakta ve uzun süreli etkisi bulunmaktadır. Giriş için çok özel reseptörlere sahiptir. Sadece prolifere olan hücreleri infekte edebilir. Transgenin ekspresyonu için
Avantajları
§ DNA’nın hücre içine sokulmasındaki verimin yüksek oluşu
§ Vektörün hücresel DNA’ya entegre oluşu
§ Vektöre uygun konakçı seçiminde seçeneklerin fazla olması gibi nedenlerden dolayı sıklıkla kullanılmaktadır.
Dezavantajları
§ Üretme aşamasında kompleks olması
§ Bölünen hücrelere entegre olabilmesi
§ Onkojenik potansiyele sahip olmaları
2-) Maloney-Murine-Lösemi Virüs (MoMLV) Vektörler
Klinik gen transfer protokollerinde halen en yaygın olarak kullanılan vektörlerdir. MaMLV vektörler, transfer için arzu edilen genlere sahip replikasyon yetenekli virüslerin üretimi için gerekli olan viral genlerin değiştirilmesi suretiyle elde edilmektedir.
(HGPRT) enziminden sorumlu insan geninin defektli olduğu Lesch_Nyhan sendromunda ve ADA eksikliğinde oluşan SCID hastalığında kullanılmıştır.
3-) Adenovirüs Vektörler
Üst solunum yolu enfeksiyonlarına neden olan; zarfsız, lineer, çift zincirli DNA’ya sahip virüslerdir. Solunum yolu epitelleri, korne ve gastrointestinal sistem için doğal bir tropizme sahiptirler. Genomu ~35 kb olup, ~ 30 kb’lık DNA’yı taşıma kapasitesine sahiptir. Yapısal proteinleri kodlayan 4 transkripsiyonel üniteye sahiptir. E1, E2, E3, E4 yapısal genleri inaktive edilmiş projenitör vektörler için, yardımcı hücre serileri kullanılır. Adenoviral vektörler, in vitro ve in vivo hedef hücre transdüksiyonunda oldukça etkilidir ve yüksek titrelerde (>1011/ml) üretilebilirler.
Gen aktarımında hedef hücre genomuna entegre olmadan, ekstrakromozomal olarak çoğalırlar. Bu nedenle uzun süre ekspresyon yapamazlar.
Avantajları:
Retrovirüslerin yalnızca bölünen hücrelere§ kendi genlerini sokabilmelerine karşın, adenovirüsler tüm hücre tiplerine aktarırlar.
§ Aerosol şeklinde kolayca elde edilebilirler.
§ Kanserleşmeyle hiçbir ilgisi bulunamamıştır.
4-) Herpes Simplex Virus (HSV) Vektörler:Hayatı boyunca nöronlarda latent durumda kalan ve M.S.S tümörlerinde tedavisi büyük bir etkinlikle kullanılan vektörlerdir. Bu vektörlere Human Herpes Virus, Human herpesvirus 3 (varicella-zoster virus 1) virüsleri örnek olarak verilebilir. Bu vektörün Dezavantajı ise sitotoksik etkilerinin olmasıdır.
5-) Adeno İlişkili Virüs Vektörleri
Non-Patojenik İnsan Parpovirüsleridir. Çoğalmak için yardımcı bir virüse (genellikle adenovirüs) ihtiyaç duyarlar. Bölünebilen ve bölünemeyen hücreleri infekte edebilirler, yardımcı virüs olmadan konağın genomunda spesifik bir noktaya (19q 13-ter) integre olabilirler. Genomu, tek iplikli lineer DNA molekülüdür.2 gen içerir;
§ rep: viral replikasyonu kontrolü, yapısal gen ekspresyonu ve konak genoma integrasyonu sağlayan proteinler
§ cap: kapsid proteinleri
Genom sonlarında 145 bç’lik terminal tekrar diziler ve bir promoter bulunur. Vektör olarak kullanılırken, rep ve cap genleri çıkartılarak transgen yerleştirilir. İnsert DNA’nın boyu, orijinal genom boyutu olan 4.7 kb’den büyük olamaz.
5-) Aşı Vektörleri
İlk kez çiçek hastalığı mücadelesinde kullanılmıştır. Bu gün, pek çok enfeksiyon ajanına karşı kişiyi immünize etmek için vektör olarak kullanılmaktadır.
En büyük avantajları;
§ Çok sayıda gen taşıyabilmeleri,
§ Isıya dayanıklı olmaları,
§ Enfekte edebilecekleri hücre tipinin çok geniş olmasıdır.
§ Çok güvenle kullanılabilecek vektör olmalarıdır.
Ör: Vaccinia ( Pox Virüs )
6-) İnsan İmmün Yetmezlik Virüs (HIV) Vektörleri
§ HIV üzerinde genetik değişiklikler yaparak insan retroviral vektörler elde etme.
§ HIV ile enfekte edilen hücrenin selektif olarak parçalanması,
§ Genetik olarak zararsız hale getirilmelerine karşın, yabanıl tip HIV virüsleri (Human Immunodeficiency Virüs) ile dikkate değer bir genetik rekombinasyon riski bulunmaktadır.
Gen Terapisinde Engeller
Gen terapisinde, nakledilecek genler hücre içi ve hücre dışı engellerle de başa çıkmak zorundadır. Hücre içi engeller, naklin yapılacağı hücreden kaynaklanır ve hücre zarı, endozom ve çekirdek zarını içerir. Hücre dışı engellerse, belirli dokulardan ve vücudun savunma sisteminden kaynaklanır. Bütün bu engeller, gen transferinin etkinliğini önemli ölçüde azaltır. Bunun ölçüsü, geni taşımakta kullanılan vektör sistemine ve naklin yapılacağı hedef dokuya bağlıdır.
Hücre zarı, geni hücreye sokma işleminde karşılaşılan ilk engeldir. Bu engel aşıldıktan sonra sırada endozomlar bulunur. Vektörün lizozomlara ulaşmadan önce endozomdan kaçması gerekir, yoksa lizozomlar taşınan tedavi edici geni enzimlerle parçalar, etkisiz hale getirirler. En son hücre içi engel çekirdek zarıdır. Yabancı DNA'ların çekirdek zarından içeri girmesi kolay değildir. Çapı 10 nm'den az olan bazı küçük moleküller ve küçük proteinler bu deliklerden kolayca geçebilirken, daha büyük moleküllerin içeriye alınması enerji gerektirir. Yabancı DNA'ların çekirdeğin içine girme mekanizması tam olarak bilinmemekle birlikte, mekanizmanın büyük moleküllerin çekirdeğe alınmasında kullanılan mekanizmaya benzediği tahmin edilmektedir. Çekirdeğin içinde ve sitoplazmada bulunan ve nükleik asitleri parçalayan nükleaz gurubu enzimler de ayrı bir problemdir.
In vivo gen terapisinde, tedavi edici genlerin hastaya direkt yolla verilmesi sonucunda vektörler, hücre içi engellerin yanı sıra hücre dışı engellerle de karşılaşırlar. Hücre dışı engeller iki kategoride incelenebilir: Dokuların kendilerine özgü yapıları ve savunma sistemi engelleri. Örneğin bağ dokusu, gen transferi için büyük bir engeldir. Eğer kas dokuya enjeksiyon yapılacaksa, kaslarda bulunan bağ dokusu katmanları, enjekte edilen vektörlerin yayılmasını ve enfekte etme yeteneklerini engeller. Epitel hücreleri vektörlerin daha derinlerdeki hücrelere ulaşmasına olanak vermez. Serumu oluşturan maddeler de çeşitli gen nakli vektörlerini etkisiz hale getirir. Örneğin çıplak DNA, serumda bulunan pek çok pozitif yüklü proteine bağlanıp etkisiz hale gelebilir. Serumdaki protein ve nükleik asitleri parçalayan proteaz ve nükleaz enzimleri de gen terapisi vektörlerini parçalayabilir.
In vivo gen terapisinde adenovirüs ya da retrovirüslerin vektör olarak kullanıldığı bazı durumlarda, bunlara karşı vücutta antikor üretildiği gözlenmiştir. Savunma sisteminin etkilerinden kurtulmak için, tedavide savunma sistemini baskılayıcı ilaçlar da kullanılmaktadır, ama onların da bazı sakıncaları vardır.
İLK GEN TERAPİSİ
İnsanda ilk gen terapisi denemesini 1990'da Dr. French Anderson gerçekleştirdi. Ex vivo gen terapisi stratejisinin kullanıldığı yöntemde, adenozin deaminaz enziminin (ADA) eksikliğinden kaynaklanan hastalığın (SCID yani Ağır kombine immün yetmezlik) tedavisi amaçlanmıştı. ADA eksikliği, çok seyrek rastlanan genetik bir hastalıktır. Normal ADA geninin ürettiği enzim, savunma sisteminin, normal fonksiyonlarını yerine getirebilmesi için gereklidir. ADA eksikliği olan hastalarda genin yaban tipi kopyası yoktur ve sahip olunan yetersiz ya da mutant kopyalarsa, işlevsel ADA enzimini üretememektedirler. ADA eksikliğiyle doğan çocuklarda, ciddi boyutlarda bir savunma sistemi sorunu vardır ve sık sık ağır enfeksiyonlara yakalanırlar. En ufak bir virüs enfeksiyonu bile yaşamsal tehlike yaratabilir. Eğer tedavi edilmezse, hastalık genellikle çocuğun birkaç yıl içinde ölümüyle sonuçlanır.
Bu ilk insan gen terapisi 2 hasta çocuk üzerinde gerçekleştirildi. Terapide, hastaların hücreleri (T-lenfosit) alınarak laboratuar şartlarında doku kültürü yoluyla çoğaltıldı. Daha sonra normal insan ADA geni, retrovirüs vektörü yardımıyla bu hücrelere nakledildi. Virüs hücrelere girerek genetik materyale geni yerleştirdi. Genetik olarak başarıyla değiştirilen hücreler seçilerek, yaklaşık 10 gün boyunca çoğaltıldı. Son aşamada da, düzeltilmiş bu hücreler kan naklini andıran biçimde damardan hastalara geri verildi. Bu işlem, yani T hücrelerinin hastadan alınması, laboratuar ortamında düzeltilmesi ve hastaya geri verilmesi, tedavinin ilk 10 ayı içinde her 6–8 haftada bir tekrarlandı. Daha sonraysa bu nakillere 6 ile 12 ayda bir devam edildi. Tedaviden 3 yıl sonra, Hastanın T hücrelerinin %50’den fazlasında normal ADA geni bulunmuştur. Fakat hücrelerin yaşam süreleri kısıtlı olduğu için ikinci bir tedavi gerektirmiştir.
Günümüzde Gen Terapisi:
§ Toplam 3496 hastaya uygulanmıştır.
§ 636 gen tedavi protokolü uygulanmıştır.
§ Kanser % 63.4
§ Monogenik hastalıklar % 12.3
§ Enfeksiyon hastalıkları % 6.4
§ Vasküler hastalıklar % 8.1
§ Diğer hastalıklar % 1.9
Kaynaklar:
§ Prof. Dr. Uğur Özbek İ.Ü. DETAE Genetik Anabilim Dalı
§ http://www.istanbultipfakultesi.com/Site/1.%20Sinif%20Ders%20Notlari_files/Gene%20therapyders-2007.ppt
§ http://www.genetikbilimi.com/genbilim/genterapisi.htm (Armağan Koçer Sağıroğlu Danışman: Bekir Sıtkı Şaylı Prof. Dr., İntergen)
§ http://aliozavsar.azbuz.com/readArticle.jsp?objectID=5000000002127755
Fenilketonüri Örneğinde Doğumsal Metabolik Hastalıklarda Gen Terapisi ile Tedavi Yaklaşımı
Sağlıklı bir vücut için, belli beslenme kurallarına uyulmalıdır. Ancak tıbbi zorunluluklar nedeniyle beslenme kurallarından sapmalar olabilir. Tıbbi besin kısıtlaması uygulanan hastalık gruplarının önemli bir örneği doğumsal metabolik hastalıklardır. Bu hastalıklarda kabaca enerji eksikliği oluşturan toksik metabolitlerle zehirlenme tablosu yaratan veya değişimi sağlanamadığından çeşitli organlarda metabolitlerin depolanmasına neden olan hastalık tabloları ortaya çıkar. Bu hastalıkların temelinde genetik bozukluk yatar. Hatalı genetik bilgi nedeni ile oluşmayan veya görevini yapmayan enzimin ürünü yoktur veya yetersizdir. Sonuçta enzimden önceki ürün birikir ve/veya alternatif yollardan başka ürünlere çevrilir. Hastalıklar letarji, koma, hipotoni, konvulsiyon, hıçkırık, apne, solunum sıkıntısı, sepsis (E. coli ile), alışılmadık koku, sarılık, dismorfi, organomegali gibi özgül olmayan bulgular ile kendini belli eder.
Fenilketonüri, fenilalanin hidroksilaz (PAH) enzimini kodlayan gendeki mutasyon nedeni ile oluşur. Unsky ve arkadaşları ilk kez 1984'te PAH lokusunu 12. kromozomda ve 12q distal parçasında gösterdiler. Fenilalaninin hidroksilasyonu en az üç enzim tarafından oluşturulur ve bunların en az ikisini etkileyen iki lokusta mutasyon vardır. Bu lokuslar da PAH apoenzimini tanımlayan allellerin etkilenmesine sebep olmuştur. Ancak mutant allellerde heterojenlik mevcuttur. Somatik gen transferi ile temel sorunun çözümü için girişimler yapılmıştır. gen transferi için aracı olarak rekombinant adenovirüs kullanılarak PAH oluşturamayan fare karaciğerine yapılan transferin başarısı tam, ancak geçici olmuş-tur. Taşıyıcı rekombinant adenovirüs, nötralizan antikorlar tarafından yok edilmiştir. 1995'te yayınlanan Goldberg ve arkadaşlarının 686 PKU'lu hastada yaptığı bir çalışma sonucunda PAH geninde 105 değişik mutasyon tespit edildi. Bu çalışmanın da gösterdiği gibi çok sayıda mutasyonu bulunması gen tedavisini oldukça güç kılmaktadır. Gelecekte yapılacaklar ile bu güçlük aşılmak zorundadır.
Kaynak: http://www.klinikpediatri.org/pdf/7/3/26.pdf (Uz. Dr. Işıl ÖZER)
Kanserde gen tedavisi stratejileri
Kanserin çok aşamalı ve kümülatif özellik gösteren bir süreç sonunda ortaya çıkması ve çok sayıda genomik değişiklik içermesi gen tedavisi için uygun olmadığı izlenimi vermekle birlikte, halen gen tedavi protokollerinin büyük çoğunluğu kanser tedavisinde kullanılmaktadır. Kanser tedavisinde kullanılan başlıca stratejiler şu şekildedir.
1. Gen işaretleme
2. İmmünmodülasyon-Kanser aşıları, polinükleotid immünizasyon
3. Biyoterapötik gen tedavisi
4. Normal doku toleransının artırılması
5. Seçici ilaç aktivasyonu- intihar genleri
6. Genetik defektin düzeltilmesi
§ Onkogenler için antisens oligonükleotidler
§ Tümör baskılayıcı genler için normal gen kopyaları
Kanserli dokularda viral yöntemlerle transdüksiyon normal dokulara göre daha başarılı olmaktadır. Viral vektörler kanserli doku kültürlerinde her yönde kolayca yayılmakta ve infekte olmayan hücrelerde de “bystander etki” nedeniyle ölüm sağlanabilmektedir. Bunun yanı sıra tek gen lezyonunun düzeltilmesi bile oldukça etkili yanıta yol açmakta ve tümörde gerileme sağlanabilmektedir.
Akciğer Kanserinde Gen Tedavisi
Kanserin genetik temeline ilişkin elde edilen bilgiler yeni tedavi olanakları yaratmaktadır. Akciğer kanserinde çeşitli onkogen ve tümör baskılayıcı gen mutasyonları tanımlanmıştır. Normal hücrelerin kanser hücrelerine dönüşümü, bu genetik lezyonların birikmesinin bir sonucu olarak görülebilir. Kanserde gen terapisi yaklaşımı bu genetik lezyonların düzeltilmesi anlamını taşımaktadır. Gen tedavisinin etkili olabilmesi için terapötik gen kodunu içeren DNA yapısının hedef hücrelere taşınması ve bu hücrelerde RNA transkripsiyonun gerçekleşmesi gerekmektedir. RNA’nın işlevsel proteinlerin sentezlenmesini sağlaması ile genetik bozukluğun düzeltilmesi, apoptozis indüksiyonu veya toksik metabolitlerin oluşumuna yol açan enzimlerin tedavi amacıyla kullanımı sağlanmış olur. Mutasyonların yol açtığı durumun gen aktarımı yoluyla tedavi edilmesi denemeleri yoğun olarak devam etmektedir. Bu tür bir yaklaşıma örnek olarak gösterebileceğimiz bir çalışmada, p53 gen mutasyonlu KHDAK (küçük hücreli olmayan akciğer kanseri) kanser hücrelerinde “wild-type” p53 gen ekspresyonu sağlamanın, bu hücrelerin radyoterapiye karşı duyarlılığını arttırdığı gösterilmiştir.(1) Gen aktarımı KHDAK kanser hücrelerinde p53 gen ekspresyonu sağlarken, kontrol olarak kullanılan insan fibroblast hiicrelerinde benzer bir etkiye neden olmamaktadır. p53 tümör baskılayıcı geninde mutasyon, KHDAK hastalarının %90’ında ve KHDAK hastalarının en az %50’sinde saptanmaktadır. Bu gen hücrenin genomik yapısının sağlamlığından, tamir edilemeyecek derecede hasarlı olan DNA varlığında hücre apoptozisinden ve hücre yaşam döngüsünü Gl fazında tutmaktan sorumludur.(2)
Hücrelere aktarımı yapılan ekzojen bir genin ekspresyonunu in vivo olarak görüntülemek, gen tedavisi çalışmaları için bir zorunluluktur. Bu amaca yönelik olarak çeşitli nükleer tip görüntüleme yöntemleri geliştirilmiştir. Bu yöntemler, gen aktarımı sırasında bir PET (pozitron emisyonu yapan F-18 (flor), O-15 (oksijen), N-13 (nitrojen) ve C-11 (karbon); gibi radyonüklidlerle işaretlenmiş moleküllerin görüntülenmesi ve bu sayede in vivo olarak biyokimyasal süreçlerin incelenmesi yöntemidir) reporter gen yapısının, terapötik genle aynı promotoru kullanmasını sağlayacak biçimde terapötik gene eklenmesi temeline dayanmaktadır. Bu genin ekspresyonunun görüntülenmesi, dolaylı olarak terapötik genin hücreye aktarımının ve hücre içi ekspresyonunun da görüntülenmesini sağlamaktadır.
Daha çok görüntüleme amacı ile kullanılan mevcut “reporter” gen yapıları iki gruba ayrılır: 1-) Hücre içi enzimlerini kodlayan genler, 2-) Hücre yüzeyi proteinlerini kodlayan genler. En çok kullanılan “PET reporter” geni, bir hücre içi enzim olan herpes simpleks virüsünün timidin kinazı kodlayan genidir. Memelilerde bulunan enzimden farklı olarak, virüs kaynaklı bu enzim, hücre içine ulaşan F–18-florogansiklovir’i fosforile eder ve hücre içinde tutulumuna neden olur. Bu şekilde bu genin ekspresyonu görüntülenmiş olur. İkinci gruba bir örnek olarak, dopamin D2 reseptör geninin aktarımı sonucunda bu genin hücrede ekspresyonunun reseptöre bağlanan F-18-floroetilsisiperon aracılığı ile görüntülenmesi verilebilir.(3) Daha önce de bahsedilmiş olduğu gibi, bu tür gen aktarımı çalışmaları, kanser tedavisinde yönlendirilmiş radyoterapinin terapötik etkinliğini arttırmak amacıyla hayvan deneylerinde yürütülmektedir.
Hücrenin endojen gen ekspresyonunun görüntülemesi için ise, nükleotid yapısındaki ürünlerine (çoğunlukla RNA) yönelik olarak, radyonüklidlerle işaretli ve hedef gen yapısına karşılık gelen (komplementer) kısa antisense oligonükleotidler kullanılmaktadır. Bu yöntem in vivo hibridizasyon olarak adlandırılmaktadır.(4) Ancak henüz bu alanda sadece sınırlı sayıda çalışma bulunmaktadır. Antisense oligonükleotidlerin kullanılması ile akciğer kanserinde onkojenlerin bloke edilmesini bir tedavi stratejisi olarak değerlendiren çeşitli faz I ve II çalışmaları yürütülmektedir.(5) Oligonükleotidlerin radyonüklidlerle işaretlenmesi gen ekspresyonunun görüntülenmesinin yanında, uygulanan tedavinin in vivo olarak etkinliğinin değerlendirilmesini de sağlayabilir.
Kaynaklar:
(1). Kawabe S, Munshi A, Zumstein LA, ve ark. Adenovirus-mediated wild-type p53 gene expression radiosensitizes non-small cell lung cancer cells but not normal lung fibroblasts. Int J Radiat Biol. 2001;77:185-194
(2). Fong KM, Minna JD. Molecular biology of lung cancer: clinical implications. Clin Chest Med 2002;23:83-101
(3). Rogers BE, Zinn KR, Buchsbaum DJ. Gene transfer strategies for improving radiolabeled peptide imaging and therapy. Q J Nucl Med 2000;44:208-223
(4). Tavitian B. In vivo antisense imaging. Q J Nucl Med 2000; 44:236-255
(5). Dy GK, Adjei AA. Novel targets for lung cancer therapy: part I. J Clin Oncol 2002;20:2881-2894
0 yorum yazılmıştır